雌激素受體-α 在調(diào)節(jié)軟骨細胞表型和機械負荷反應(yīng)中的新作用

雖然骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)病機制是多因素的，但關(guān)節(jié)表面的機械超負荷是 OA 發(fā)病和進展的已知驅(qū)動因素。軟骨細胞衰老被認為是 OA 軟骨的一個重要特征。研究表明，人軟骨細胞在動態(tài)壓縮負荷大于 20% 時，可誘導(dǎo)衰老相關(guān)標志物的表達，然而，機械負荷影響軟骨細胞衰老的機制仍有待闡明。

研究報道，與健康對照組相比，OA 患者軟骨細胞上的雌激素受體-α（ERα）水平降低。此外，在 OA 的體外模型中，用促炎細胞因子白細胞介素1β（IL-1β）刺激軟骨細胞上調(diào) microRNA 203（miR-203）表達，從而拮抗 ERα 功能，導(dǎo)致炎癥增加，細胞活性和軟骨生成基質(zhì)蛋白表達降低。這支持 ERα 在介導(dǎo)軟骨細胞表型中的作用。有趣的是，發(fā)現(xiàn)靜水壓力形式的機械負荷可以通過 ERα 調(diào)節(jié)成骨，這支持通過 ERα 探索軟骨形成表型的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。

鑒于此，美國匹茲堡大學醫(yī)學院骨科及中國中南大學湘雅醫(yī)院骨科的研究團隊曾證明了ERα 是 OA 中軟骨細胞表型的重要調(diào)節(jié)因子，包括調(diào)節(jié)衰老和降解酶的產(chǎn)生。特別是，ERα 缺失的軟骨細胞通過顯著提高與肥大和成骨相關(guān)的分子的表達水平來響應(yīng)損傷性的機械負荷，這是 OA 軟骨中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵特征。因此，恢復(fù)和維持軟骨細胞中的 ERα 功能可能代表了 OA 的未來治療干預(yù)。研究成果發(fā)表在Osteoarthritis and Cartilage期刊題為“Novel role of estrogen receptor-α on regulating chondrocyte phenotype and response to mechanical loading”。

首先，研究人員從接受 TKA（全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)）的患者中收集人類 OA 膝關(guān)節(jié)軟骨組織，所有保存的軟骨均有輕微至輕度的宏觀損傷，對照軟骨樣本表面完整，受損軟骨樣本表現(xiàn)出嚴重的退化。

與對照軟骨相比，受損軟骨含有較少的糖胺聚糖（GAG），并顯示出更高水平的 MMP13、p16INK4a和 SA-β-gal。為了證實組織學結(jié)果，從保存的（P-CHs）和受損（D-CHs）軟骨中分離出軟骨細胞（CHs），進行 qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡檢測，發(fā)現(xiàn) D-CHs 在衰老、炎癥、纖維化、成骨和降解相關(guān)基因方面的表達水平高于 P-CHs。蛋白質(zhì)印跡分析進一步證實了 D-CHs 的衰老和骨關(guān)節(jié)炎特征，如較高水平的 p16INK4a、p21 和 MMP13。通過檢測 P-CHs 和 D-CHs 的軟骨形成能力，發(fā)現(xiàn) D-CHs 產(chǎn)生的軟骨顆粒通常遺傳了受損軟骨的表型，如低 GAG 沉積和高水平的細胞衰老（圖1 A）。

總的來說，與保存的對照軟骨和 P-CHs 衍生組織相比，受損的軟骨和 D-CHs 衍生組織表現(xiàn)出更高水平的衰老、炎癥、纖維化、成骨和降解。

由于p16INK4a在 D-CHs 中顯著上調(diào)，因此測試了抑制 p16INK4a是否可以逆轉(zhuǎn) D-CHs 中的 OA 表型（圖1 B）。結(jié)果表明，在 2D 軟骨細胞培養(yǎng)上，sip16INK4a處理顯著降低 p16INK4a水平（圖1 F），并部分逆轉(zhuǎn)衰老水平（圖1 C、D）。但是，p16INK4a 抑制的 D-CH 顆粒在軟骨生成刺激下無法產(chǎn)生軟骨（圖1 E），盡管軟骨生成基因水平?jīng)]有顯著受損（圖1 D）。此外，抑制 p16INK4a促進了 MMP13 的表達（圖1 D、F）。這說明，在 D-CHs 中抑制 p16INK4a不會增強 D-CHs 在體外生成健康軟骨的能力。

圖1 通過siRNA抑制D-CHs中的p16INK4a在逆轉(zhuǎn)D-CHs的不良表型方面

接下來，為了確定對照和受損組軟骨之間的差異因子，進行了 RNA-Seq 分析以檢查 P-CHs 和 D-CHs 的轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果顯示，D-CHs 中軟骨降解相關(guān)基因的變化最大。有趣的是，雌激素受體家族和雌激素受體-1（ESR1），一種編碼雌激素受體-α（ERα）的基因，都位列上游調(diào)控因子的前5名。與 P-CHs 相比，D-CHs 的 ESR1 表達顯著降低。ERα 的下游靶點顯示，許多與軟骨功能和 OA 相關(guān)的基因被預(yù)測受ERα調(diào)控，包括p16INK4a。通過檢測不同樣本中的 ERα 水平，驗證了ERα 在嚴重損傷的軟骨中下調(diào)。

由于 D-CHs 表現(xiàn)出低 ERα 表達，因此測試了升高 ERα 是否可以逆轉(zhuǎn) D-CHs 的 OA 表型。結(jié)果表明，增強 ERα 水平不僅降低了衰老水平且增加了增殖潛力，同時也改善了 OA 表型。這說明，ERα 可調(diào)節(jié)軟骨細胞表型。

由于軟骨損傷最常見于體內(nèi)機械應(yīng)力最高的膝關(guān)節(jié)區(qū)域，因此實驗還研究了降低的 ERα 水平是否與機械負荷有關(guān)，以及降低的 ERα 水平是否改變了軟骨細胞對機械負荷的反應(yīng)。實驗過程中使用了0.2Hz，0%、5% 和 20% 的應(yīng)變，分別代表了靜態(tài)、中等負荷和損傷性負荷的情況。結(jié)果顯示，5% 或 20% 動態(tài)壓縮負荷下，軟骨細胞 ESR1 的表達降低（圖2 B、C、F）。此外，20% 負荷會導(dǎo)致 siCON 細胞中分解代謝基因（如 ADAMTS4 和 MMP13）的上調(diào)，以及衰老標志物（包括p16INK4a和p53）的增加（圖2 B、D-F）。這說明，ERα 水平受機械負荷的調(diào)節(jié)。

考慮到 ERα 對軟骨細胞衰老和軟骨形成表型的影響，以及其對機械負荷的反應(yīng)，實驗還研究了 ERα 在調(diào)節(jié)壓縮負荷對軟骨細胞表型的影響中的作用。結(jié)果顯示，當存在 ESR1 表達時，20% 應(yīng)變下的機械負荷不再引起先前看到的 p16INK4a和 MMP13 表達的增加。相反，敲低 ESR1 表達時施加機械負荷會降低這兩種分子的表達（圖2 B、D-F）。值得注意的是，機械負荷和 ESR1 敲低都增加了 P-CHs 中磷酸化的 p65（pho-p65）的水平，這是細胞應(yīng)激的代表性標志物。這些數(shù)據(jù)說明，抑制 ERα 會改變軟骨細胞對壓縮負荷的反應(yīng)性。

圖2 ERα在介導(dǎo)軟骨細胞對機械負荷反應(yīng)中的作用—檢測分解代謝

最后，實驗進一步研究了機械負荷和 ERα 表達在調(diào)節(jié)軟骨生成、纖維化和成骨基因中的相互作用。當 ESR1 表達保留（siCON）時，5% 和 20% 應(yīng)變下的機械負荷對成骨或纖維化標記基因的表達沒有顯著影響，盡管 OSX 和 VCAN 在 20% 壓縮應(yīng)變下顯著上調(diào)（圖3 A）。然而，COL2A1 存在應(yīng)變反應(yīng)性的下調(diào)（圖3 D）。有趣的是，單獨敲除 ESR1 （0% siESR1）顯著上調(diào)了 OCN 的表達，同時抑制了 COL2A1 和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP） 的水平（圖3 A-D）。雖然 5% 的應(yīng)變壓縮負荷對 ESR1 敲除沒有緩解作用，但20% 的應(yīng)變傾向于進一步上調(diào)肥大相關(guān)標志物，包括 COL10 和 OCN（圖3 B-D），同時還逆轉(zhuǎn)了 ESR1 敲除對 COL2A1 和 COMP 水平的抑制作用（圖3 D）。值得注意的是，與 P-CHs 相比，在人類的 D-CHs 中也觀察到 OCN 水平的提高（圖3 E、F），并且與野生型對照相比，在從 ESR1 敲除小鼠中分離的軟骨中也觀察到 OCN 水平增強（圖3 E、G）。這說明，ERα 的缺失和壓縮超負荷協(xié)同增加軟骨細胞的肥大轉(zhuǎn)化。

應(yīng)該注意的是，瞬時受體電位陽離子通道亞家族v 成員4（TRPV4）的表達是一種公認的機械敏感 Ca2+ 通道，對機械負荷也有反應(yīng)。在 siCON 組中，5% 的負荷顯著上調(diào)了 TRPV4 的表達，然而，較高的壓縮應(yīng)變（20%）適度降低了 TRPV4 的表達（圖3 D）。此外，ESR1 敲除不會改變 TRPV4 蛋白水平，但確實調(diào)節(jié)了機械負荷的影響，因為增加應(yīng)變幅度會誘導(dǎo) TRPV4 表達可觀察到的劑量依賴性增加（圖3 D）。

基于上述研究的結(jié)果，ERα 在調(diào)節(jié)軟骨細胞表型和對機械超負荷反應(yīng)中的途徑如圖4所示。

圖3 ERα在介導(dǎo)軟骨細胞對壓縮負荷反應(yīng)中的作用—檢測軟骨形成

圖4 ERα信號通路在調(diào)節(jié)軟骨細胞表型中的作用。

總之，該研究表明，ERα 在介導(dǎo)軟骨細胞表型及其對機械負荷的反應(yīng)中具有新的雌激素非依賴性作用，并表明提高 ERα 水平可能代表了一種治療骨關(guān)節(jié)炎的新方法。